버섯균주 보존법

- 퇴화 : 버섯균주는 보존 중에 생장이 지연되거나 수량이 감소하고 기형버섯이 발생하는 등의 현상이 나타난다.

- 세포가 퇴화하는 원인

• 영양분 감사
• 산소 결핍
• 유독물질 축적
• pH악변
• 필수 세포성분의 손실 등

- 버섯균주의 보존 목적 : 장기간에 걸쳐 균주가 살아 있으면 유전, 형태, 생리적으로 변화가 일어나지 않고 버섯균만을 순수하게 보존하는 것

 

- 버섯균주의 보존방법 : 계대배양 보존법, 유동파라핀 봉입법(광유보존법), 물보존법, 동결건조법 등

 

 

1. 계대배양 보존법

 

- 계대배양 : 배지에 생장된 균사를 새로운 배지에 옮겨주는 과정(일반적인 버섯균주 보존방법), 균주를 배지에 키워 일정 온도에 보존하면서 일정기간마다 새로운 배지로 이식하여 배양 후 보존하는 방법

 

- 단점 : 계대배양은 생육을 계속 유지해야 하므로 여러차례 이식해야 하는 불편함이 있다. 보존과정 중 환경조건이 불량하든가 균체로부터 분리되는 대사물질에 의해 본래의 특성이 변이되거나 퇴화할 위험이 있다.(따라서 적기에 이식배양해야 한다,)- 장점 : 형질의 안정성이 높다. 

 

- 환경조건의 변화 : 보존 중에는 균체의 성장을 억제하고 대사물질의 집적을 감소시키기 위하여 탄소원과 질소원을 적게 이용하도록 환경조건을 변화시켜야 한다.

 

- 균사생장의 적온 : 

• 대부분의 버섯 : 20~25℃
• 보존온도 : 4~6℃ 단, 고온성 버섯(풀버섯)은 10~15℃, 저온성 버섯(팽이버섯) 1~4℃에서 보존

- 균주 보존의 습도 : 상대습도 70% 내외(습도가 높을 경우 잡균에 오염되기 쉽다)

 

- 균주 보존중의 광 : 균주 보존 중에 빛이 있으면 버섯이 발생되기 쉽고 버섯이 발생한 후에는 잡균오염이 더욱 용이하므로 빛이 없는 어두운 장소에 보관한다.

 

- 유산지의 이용 : 균주 보존 시 면전을 통하여 수분이 증발되어 배지가 건조하기 쉽고 잡균이 오염될 가능성이 높으므로 면전을 한 경우에는 그 위에 유산지를 씌워 두면 더욱 안전하다.

 

- 균주의 보존 장소 : 실온에서 계대배양만 하여 보존할 때는 약 1개월 마다 이식할 수 있으나, 특수한 균주는 15일 내외에서 이식하여야 하므로 보존균주의 특성에 맞게 보존하여야 한다. 그러나 대부분의 버섯은 균사를 배양한 다음 저온에서 보존할 경우에는 2~3개월마다 이식배양하면서 보존할 수 있다.

 

 

2. 유동파라핀봉입법(광유보존법)

 

- 유동파라핀 : 파라핀계 고급탄화수소로 매우 잘 정제된 광물성의 흰색 액체기름

 

- 보존방법 : 계대배양 보존법과 마찬가지로 시험관 내 균사를 배양한 다음 공간에 유동파라핀을 넣어 배지가 건조되는 것을 방지하고 산소공급을 차단하여 호흡을 최대한으로 억제시켜 대사속도를 지연되게 하는 장기보존방법.

 

- 유동파라핀 봉입방법

• 균이 배양된 시험관에 비중이 0.8~0.9인 백색 유동파라핀을 121℃에서 60~120분간 고압살균한 뒤 110~170℃에서 1~2시간 건조하여 수분을 증발시킨뒤 냉각하여 준비된 시험관에 넣는다.
• 시험관에 넣고 나면 기포가 들어있어 1일 정도 정치하면 기포가 없어진다. 따라서 기포가 없어진 만큼 유동파라핀의 체적이 감소되기 때문에 다음 날 추가할 필요가 있다.
• 유동파라핀의 주입량은 시험관 내 사면의 높이보다 1cm 정도 높게 넣는다. 이때 유동파라핀의 양이 2cm 이상 많으면 혐기성 상태가 되기 때문에 보존에 어려움이 있으므로 양을 알맞게 조절하여야 한다.
• 유동파라핀을 넣은 후에 보존실의 온도가 4~6℃ 이고 습도가 70% 내외인 장소에 보존하면 1~3년간 보존이 가능하지만 안전하게 보존하기 위해서는 2년 마다 교체하여야 한다.

 

 

 

3. 물 보존법

 

- 물 보존 방법

- 멸균한 증류수에 균사, 포자 또는 균사를 포함한 한천절편을 넣어 보존하는 방법

 

- 물 보존을 위해서 2ml 의 마이크로튜브, McCartney 병, 나사식 뚜껑을 가진 시험관 등을 사용한다

 

- 적정 한천평판배지에 버섯을 배양하여 균사가 배지의 가장자리까지 자라면 적당한 크기의 코르크보러 또는 칼을 이용하여 생육이 왕성한 가장자리의 균사를 떼어낸다.

 

- 떼어낸 균사를 가압멸균한 멸균수(보존용기의 1/2~2/3 가량 채움)의 절반가량을 채우고 뚜껑을 돌려서 단단히 닫은 후에 파라필름으로 봉한다.

 

- 보존온도 : 10~16℃가 적당하다.

 

- 균주는 한천의 영양분을 이용하여 일시적으로 생장하지만 곧 병 안의 산소가 고갈되어 더 이상 자라지 않는다

 

- 한천배지 없이 균사체나 포자만을 넣는 경우는 병내에서의 생장은 휠씬 감소한다.

 

- 이 방법은 손 쉽고 저렴하여 많이 이용되고 있다.

 

 

 

4. 동결건조법(진공냉동건조 보존법)

 

- 냉동건조 보존법(동결건조법) : 미생물을 페니실린병과 같은 병에 넣어 동결시킨 뒤 진공상태에서 수분을 기화시켜 세포 내의 수분을 대부분 제거하여 세포가 휴면상태가 된 것을 장기 보존하는 방법이다.

 

- 이 방법은 버섯의 포자를 장기보존하기에는 알맞은 방법이나 균사체를 장기보존하는데는  많은 문제점이 있다.

• 즉, 균사체로 보존하기 위해서는 균사의 배양조건, 보호제의 종류, 동결조건, 건조조건 등이 균의 종류에 따라서는 균사체를 냉동건조 보존할 수 없는 종류도 있다.

 

동결건조법의 종류

• -40~0℃에서 보존하는 냉동보존법
• -100~80℃에서 보존하는 초저온 냉동건조법
• -196℃의 액체질소(LN2)를 이용하는 액체질소법, 액체질소법은 설치, 운영비용이 높지만 안정성이 우수하다. 동결보호제로는 10%글리세린이나 10% 포도당을 이용한다.